关键词: DNA损伤, 糖尿病足溃疡, 炎症反应

Abstract: Objective To explore the correlation between DNA damage and inflammatory responses in diabetic foot ulcer wounds.Methods From March 2024 to February 2025, 25 patients with diabetic foot ulcers were admitted as the experimental group, and 25 patients without diabetic trauma were taken as the control group.Skin tissue samples were collected from wounds of both groups for fixation, immunofluorescence assessed γ-H2A.X and cGAS expression, ELISA measured IL-6 and TNF-α levels, RT-PCR determined NF-κB p65 and IkB-α mRNA levels, whilst Western blotting evaluated γ-H2A.X and cGAS expression.Results The expression levels of γ-H2A.X and cGAS in the wound tissue of the patients in the experimental group were (63.0±4.36) and (32.7±6.43), respectively, which were significantly enhanced compared with those in the control group (49.3±5.13 and18.3±2.89).The expression levels of IL-6 in the experimental group and the control group were (4.50±0.64)pg/ml and (3.11 ±0.47)pg/ml, respectively.The expression levels of TNF-α were (224.67±24.06)pg/ml and (205.60±20.44)pg/ml, respectively.There was a statistically significant difference between the two groups (P<0.05).RT PCR results suggest The expression levels of NF-κB p65 in the wounds of the experimental group and the control group were (0.056±0.011)pg/ml and (0.036±0.006)pg/ml respectively, and the expression levels of IkB-α were (0.030±0.008)pg/ml and (0.017±0.006)pg/ml, respectively.There was a statistically significant difference between the two groups (P<0.05).The results of Western blotting suggest The expression levels of γ-H2A.X in the experimental group and the control group were 0.89±0.040 and 0.69±0.046 respectively, and the expression levels of cGAS were 0.48±0.035 and 0.26±0.048 respectively.There was a statistically significant difference between the two groups (P<0.05).Conclusion DNA damage is closely linked to inammatory responses in diabetic foot ulcer woundss. [Key Words] DNA damage; diabetic foot ulcers; inflammatory response 糖尿病足溃疡(DFU)是糖尿病病人晚期严重并发症之一, 2型糖尿病病人出现DFU风险高达25%^[1]. 目前, DFU的治疗效果仍不满意, 15%~20%的中重度感染最终引起病人下肢截肢^[2-3]. 有研究表明, 过量炎症反应是导致DFU伤口难愈的重要原因之一^[1]. Weigelt等^[4]研究发现, 糖尿病足伤口组织中白细胞介素(IL)-6等炎症介质水平明显升高. 本团队前期研究发现, DFU伤口NOD 样受体蛋白 3(p65NLRP3), 核因子(NF)-κB p65含量明显高于对照组^[5-6]. 典型的炎症反应可分为炎症诱导物, 炎症反应传感器, 诱导的炎症介质以及下游靶组织^[7]. DNA损伤是内外源性刺激如致病菌毒性代谢产物等威胁细胞基因组的稳定性, 引起包括DNA双链断裂(DSBs)在内的损伤, DSBs是DNA损伤后果最严重的一种^[8]. H2A.X是染色质核小体的核心成分之一, 在DSBs早期, H2A.X可被共济失调-毛细血管扩张突变蛋白(ATM)及ATM-Rad3 相关蛋白(ATR)磷酸化为γ-H2A.X, 并大量募集于DNA损伤位点, 被认为是DSBs发生的重要标志^[9]. 本研究检测糖尿病足病人伤口皮肤组织炎症因子以及DNA损伤标志物, 探讨DNA损伤在糖尿病足伤口炎症反应发生发展中的机制. 对象与方法 一, 对象 2024年3月~2025年2月收治的DFU病人25例为试验组, 25例无糖尿病开放伤口病人(车祸伤, 下肢开放性伤口以及骨折术后未愈伤口等)为对照组. 纳入标准: (1)年龄18~80岁; (2)明确诊断为糖尿病足溃疡; (3)伤口Wagner分级为2~4级. 排除标准: 严重心脑肺功能异常; 下肢静脉性溃疡; C反应蛋白(CRP)>100mg/L和踝肱指数(ABI)<0.4; 有精神类疾病等或无法合作. 本研究经过医院伦理委员会批准(青医2021-20), 所有病人均签署入组知情同意书. 二, 方法 1.临床资料收集: 包括性别, 年龄, 身体质量指数(BMI), 丙氨酸氨基转移酶(ALT), 肌酐, CRP, 创面大小, 溃疡时间, 空腹血糖, 当前吸烟, 当前饮酒, ABI, 动脉硬化指数[(总胆固醇mmol/L-高密度脂蛋白胆固醇mmol/L)／高密度脂蛋白胆固醇mmol/L]和高血压既往史. 入院后进行伤口细菌培养, 根据培养和药敏结果, 采用合适抗生素. 2.标本采集: 入院时采集两组病人的伤口周围肉芽组织(大小约1.0cm×0.5cm×0.5cm), 一半伤口组织通过福尔马林固定液保存, 另一半伤口组织置于-80℃冰箱保存. 3.HE染色及免疫荧光: 取伤口组织进行包埋切片, 然后进行苏木精-伊红染色(HE)和免疫荧光染色, 观察伤口组织炎症反应. 为观察γ-H2A.X和环磷酸鸟苷-腺苷合成酶(cGAS)的表达定位, 取组织切片, 4%多聚甲醛固定, 血清孵育15分钟后加入一抗(γ-H2A.X或cGAS), 37℃孵育过夜, PBS冲洗, 加入二抗(抗兔IgG), 室温孵育1小时, PBS冲洗, 加入DAPI染色5分钟, 封片后免疫荧光显微镜观察, 定量两组之间的荧光强度表达差异. 4.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测: 伤口组织匀浆加入PBS, 离心取上清液, 通过ELISA试剂盒(e Bioscience公司)检测伤口组织IL-6和TNF-α水平, 利用酶标仪测定450nm处吸光度值, 计算IL-6和TNF-α含量. 5.蛋白印迹法(Western blotting)检测: 提取伤口组织总蛋白, 使用BCA试剂盒计算蛋白浓度, 丙稀酰胺凝胶电泳后(SDS-PAGE), 转膜后TBST缓冲液洗膜后封闭. 加入γ-H2A.X或cGAS一抗, 4℃孵育过夜, 加二抗, 孵育50分钟, 显色剂显色, Image J软件分析电泳带灰度值. 6.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR): Trizol法提取两组病人伤口组织总RNA, 紫外-可见光分光光度计定量RNA浓度. 选取标本RNA后, 通过反转录试剂盒步骤, 将RNA反转录合成cDNA. 利用软件设计PCR引物(表1). 检测伤口皮肤核因子-κB p65(NF-κB p65)和κB抑制蛋白 α(IkB-α)的mRNA表达量. 表1 本研究使用的PCR引物 项目5’- 3’ NF-κB p65 FGAATGGCTCGTCTGTAGTG RTGGTATCTGTGCTCCTCCTC NF-κB IkB-α FGGAGAAGTTCGGTTTAGTAGCC RTTTATTCCTGTTTCACGCTCA GAPDH FATGGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC RGCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC 三, 统计学方法 采用SPSS 20.0软件分析数据. 计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用独立样本t检验; 计数资料以例(%)表示, 采用χ2检验. P<0.05为差异有统计学意义. 结果 1.两组病人一般资料比较: 两组病人年龄, BMI, ALT, 肌酐, CRP, 创面大小, 溃疡时间, 当前吸烟, 当前饮酒, ABI和合并高血压比例比较, 差异无统计学意义(P>0.05), 入院时病人随机血糖比较, 差异有统计学意义. 见表2. 表2 两组病人入院一般资料比较 一般资料对照组 (25例)试验组 (25例)t/χ²P 年龄(岁)54.7±9.4456.8±9.370.7970.430 性别(例, %) 男16(64.0)14(56.0)0.3330.564 女9(36.0)11(44.0)0.3330.564 BMI(kg/m2)23.1±3.7623.5±3.810.3300.743 ALT(U/L)36.4±9.8333.3±8.781.1980.237 肌酐(mmol/L)58.1±15.2764.4±17.771.3490.184 CRP(mg/L)72.6±26.9064.1±31.131.0350.306 创面大小(cm²)17.5±8.9215.2±8.910.9040.370 溃疡时间(天)40.1±25.5734.6±22.250.8140.419 随机血糖(mmol/L)9.4±1.617.5±4.52.9380.042 当前吸烟(例, %)6(24.0)10(40.0)1.4710.225 当前饮酒(例, %)10(40.0)16(64.0)2.8550.089 ABI0.6±0.130.8±0.140.5690.572 动脉硬化指数4.9±0.175.1±0.181.0820.340 合并高血压(例, %)10(40.0)13(52.0)0.7250.395 A: 对照组(HE×40); B: 对照组(HE×100); C: 对照组(HE×400); D: 试验组(HE×40); E: 试验组(HE×100); F: 试验组(HE×400) 图1 两组病人伤口组织的HE染色结果 表3 两组病人伤口组织炎症介质蛋白和炎症信号通路基因表达水平 组别例数IL-6(pg/ml)TNF-α(pg/ml)NF-κB p65 mRNANF-κB IkB-α mRNA 对照组253.11±0.47205.60±20.440.036±0.0060.030±0.008 试验组254.50±0.64224.67±24.060.056±0.0110.017±0.006 t6.7982.3396.0283.660 P0.0010.0270.0010.001 2.HE染色情况: 两组病人伤口组织中均有不同程度炎细胞浸润, 以中性粒细胞为主, 且试验组伤口组织中性粒细胞的浸润较对照组更加明显, 差异有统计学意义(400倍视野中, 随机中性粒细胞计数735±65 vs.448±82, P＜0.05), 见图1. 3.免疫荧光染色情况: 两组病人伤口组织免疫荧光染色结果提示, 试验组伤口组织和对照组γ-H2A.X表达水平分别为63.0±4.36 和 49.3±5.13, cGAS表达水平分别为32.7±6.43 和 18.3±2.89, 两组比较差异有统计学意义(P＜0.05). 绿色荧光显示为γ-H2A.X和cGAS, 蓝色荧光显示为细胞核(图2). 4.ELISA检测情况: 结果显示, 试验组病人伤口组织中IL-6和TNF-α表达水平明显高于对照组, 差异有统计学意义(P<0.05). 见表3. 5.PCR检测结果: 试验组病人伤口组织中NF-κB p65及NF-κB IkB-α mRNA相对表达量均高于对照组, 两组比较差异有统计学意义(P<0.05). 见表3. 6.伤口组织γ-H2A.X和cGAS含量比较: Western blotting结果显示, 试验组病人伤口γ-H2A.X和cGAS表达水平明显高于对照组, 差异有统计学意义(P<0.05). 见图3. 讨论 目前, 糖尿病足伤口不愈合以及延迟愈合机制仍 A: 对照组γ-H2A.X表达情况; B: 对照组细胞核染色情况; C: 对照组γ-H2A.X及细胞核染色组合图; D: 试验组γ-H2A.X表达情况; E: 试验组细胞核染色情况; F: 试验组γ-H2A.X及细胞核染色组合图; G: 对照组cGAS表达情况; H: 对照组细胞核染色情况; I: 对照组cGAS及细胞核染色组合图; J: 试验组cGAS表达情况; K: 试验组细胞核染色情况; L: 试验组cGAS及细胞核染色组合图 图2 两组伤口组织γ-H2A.X和cGAS胞内表达分布情况 A: γ-H2A.X和cGAS蛋白条带显色结果; B: γ-H2A.X蛋白灰度值结果; C: cGAS蛋白灰度值结果. a为P<0.05 图3 两组病人入院伤口组织γ-H2A.X和cGAS蛋白表达水平 不清楚. 在正常伤口愈合过程的早期, 炎症细胞以及介质趋化至伤口组织, 通过杀灭并清除细菌等有害物质促进伤口愈合^[10]. 过量炎症因子在伤口聚集, 降解伤口组织基质金属蛋白酶, 影响新鲜肉芽组织形成及伤口愈合^[11]. 本课题组前期研究发现, 糖尿病足伤口存在炎症因子的过量表达并引起创面的延迟愈合或不愈合^[5-6]. 本研究结果提示, 试验组糖尿病足病人伤口炎症细胞浸润程度高于对照组, 与Grant等^[12]和Lee等^[13]研究结果一致. 因此糖尿病病人机体组织长期处于慢性炎症反应状态, 一旦皮肤溃破, 炎性细胞浸润增多, 加剧伤口局部炎症反应, 并贯穿伤口创面愈合过程, 导致糖尿病足创面的延迟愈合或不愈合. IL-6由活化的单核巨噬细胞分泌, 主要功能是活化T淋巴细胞, 合成CRP. TNF-α是单核细胞分泌的一种细胞因子, 参与感染, 创伤, 自身免疫等炎症性疾病的发生发展^[14]. 本研究结果表明, 糖尿病病人IL-6及TNF-α的水平高于对照组, 说明高糖环境可诱发炎症反应, 激活单核巨噬细胞, 提高伤口局部组织炎症因子水平. Weigelt等^[4]研究发现, 糖尿病足病人伤口中CRP和IL-6炎症介质分子水平明显升高. 因此, 过量的IL-6及TNF-α可能是影响糖尿病足伤口愈合的关键因素. cGAS是识别胞质内DNA的重要识别器之一, 在炎症反应中具有重要的调节作用^[15]. cGAS在识别胞质DNA损伤后, 产生活化的环鸟苷酸-腺苷酸(cGAMP), 介导STING信号通路上调NF-κB水平, 启动大量促炎因子, 趋化因子, 参与炎症反应的调节^[16]. 本研究免疫荧光以及Western blotting结果显示, 试验组伤口组织DNA损伤感应器cGAS和DSBs标志物γ-H2A.X含量高于对照组. Jiang等^[17]报道, LPS刺激可导致单核细胞中DSBs以及感应器cGAS表达增加, 且参与炎症因子如TNF-α等的转录和合成调节. 有研究发现, 正常情况下 cGAS存在于细胞质中, 有丝分裂中高糖环境可能导致cGAS被募集至细胞核中, 参与DNA损伤的应答反应, 调节伤口组织的炎症反应^[18], 与Gluck等^[19]研究结果一致, 以上结果提示DNA损伤加重糖尿病足溃疡伤口炎症反应, 延迟伤口愈合. 综上所述, 糖尿病足病人伤口创面存在过量炎症反应, DNA损伤及其感应器cGAS在糖尿病足伤口的过量炎症中扮演着重要作用, 可为DFU的治疗提供新的治疗靶点. DNA损伤具体通过何种路径加重糖尿病足伤口炎症反应作用机制仍需进一步验证. 参考文献 [1] Mc Dermott K, Fang M, Boulton AJM, et al.Etiology, Epidemiology, and Disparities in the Burden of Diabetic Foot Ulcers[J].Diabetes Care, 2023, 46(1): 209-221. 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